Dar cum să recunoaștem poziția fragmentelor? Pentru aceasta, este necesar să se utilizeze o „sondă”, adică un mic fragment de ADN marcat cu un izotop radioactiv sau cu un radical care emite lumină în anumite condiții. Fiind și un fragment de ADN, sonda conține o secvență care completează doar un singur tip de secvență invariantă deja cunoscută prezentă în fragmentul studiat, care va permite legarea ambelor.
Cu utilizarea filmului fotografic, se descoperă poziția sondei și, prin urmare, a fragmentului. În cazul siturilor cu un singur sit - care apar doar o dată în întregul genom - există întotdeauna două „alele”, deoarece celulele (cu excepția celor reproductive) au câte o pereche din fiecare cromozom. Deoarece alelele au aceeași secvență de bază și dimensiuni diferite, o sondă complementară acelei secvențe se va lega de ambele și vor apărea în poziții diferite pe filmul fotografic. Toți oamenii primesc una dintre aceste alele de la mamă și una de la tată.
Prin urmare, în testul de paternitate, este suficient să comparați alelele mamei, ale copilului ei (a) și ale presupusului tată și coincidența alelei paterne a copilului cu o alelă a presupusului tată va confirma paternitatea "biologic". Când doriți doar să investigați identitatea unei persoane (un criminal, de exemplu), trebuie să faceți acest lucru comparați modelul de polimorfism al probelor de ADN obținut la locul faptei cu modelele mai multor suspecți.
Sinteza fragmentelor de ADN
Pentru a detecta polimorfismul, se folosesc primeri care flancează regiuni ale ADN-ului în care există repetări de nucleotide (în grupuri de doi, trei sau mai mulți). Aceasta înseamnă că astfel de primeri delimitează sinteza noilor fire către întindere cu repetări, situate între siturile de care se leagă. Astfel de repetări se numesc STR (Short Tandem Repeats, sau „repetări scurte în serie”), iar regiunile în care se găsesc sunt cunoscute ca „microsateliți”.
ADN mitocondrial
Pe lângă ADN-ul genomic, prezent în nucleul celulelor, există și ADN în mitocondrii, organite situate în citoplasmă. Acest ADN este mult mai mic decât cel nuclear și are o structură circulară, ceea ce îl face mai asemănător cu cel al bacteriilor.
În contextul analizei criminalistice, interesul pentru ADN-ul mitocondrial a apărut din mai multe motive: în primul rând, acest ADN conține și regiuni polimorfe care permit individualizarea acestuia; în al doilea rând, descendenții primesc acest ADN numai de la mamă, ceea ce face posibilă urmărirea descendenței materne a unei persoane; și în al treilea rând, acest ADN este mai rezistent la degradare decât ADN-ul nuclear. Astfel, în caz de catastrofe majore (incendii, explozii, accidente de avion etc.), când este mai dificil de identificat corpurile, se analizează ADN-ul mitocondrial. Acest lucru este extras din rămășițe și secvența de interes este comparată cu secvențele obținute de la frați sau strămoși materni.
Gradul de încredere în testarea ADN-ului
Un punct care a generat discuții intense între laboratoare și agențiile de testare a ADN este numărul locurilor polimorfe necesare pentru a stabili în mod fiabil identitatea și paternitatea. Indicele utilizat pentru concluzii, atât pe identitatea unei persoane, cât și pe paternitate, depinde de numărul locurilor analizate. Pentru a ajunge la un indice adecvat, totuși, este necesar să se țină seama de frecvența alelelor din populație: dacă sunt foarte frecvente, rezultatele analizelor vor fi, cel puțin, dubioase.
Grupurile sanguine (A, B, O și AB) pot fi utilizate ca exemplu. Astfel de grupuri, care depind de combinația de alele, sunt distribuite în populații din întreaga lume cu frecvențe cunoscute. În Germania, 46% - 48% au sânge de tip A. În Eurasia Centrală, India, Mongolia și Siberia prevalează tipul B. Prin urmare, în niciuna dintre aceste regiuni aceste grupe sanguine nu ar putea fi utilizate izolat pentru a identifica un individ, deoarece un procent mare din populație ar avea una sau alta. Este important ca alelele cercetate să fie rare.
În cazul polimorfismelor ADN (RFLP), frecvențele sunt mult mai mici. De exemplu, să ne imaginăm o dispută de paternitate în Rio de Janeiro în care se folosește locusul D10S28 ca sondă, permițând obținerea, în presupusul tată, a unei alele care apare la aproximativ 2,8% din populația din Rio de Janeiro. Această valoare este foarte mare dacă avem în vedere că populația orașului este de aproximativ 8 milioane de locuitori. Pentru a reduce această valoare, este necesar să căutați alte loci la același individ. Să ne imaginăm că o a doua analiză, folosind locusul D2S44, a dezvăluit o alelă cu o frecvență de 7,28%, procent care indică existența a 582.000 de oameni în Rio de Janeiro cu această alelă.
Dar câți indivizi ar avea ambele alele? Doar 16.307. Acest număr se obține înmulțind inversul celor două frecvențe: 2,8 / 100 x 7,28 / 100 x 8 milioane. Folosind încă o locomotivă, analiza va indica o altă frecvență, permițându-vă să reduceți în continuare procentul. În practică, utilizarea a cinci până la șapte sonde generează o valoare suficient de scăzută pentru ca rezultatul să fie concludent.
Sursă: Școala din Brazilia - https://brasilescola.uol.com.br/biologia/sintese-fragmentos-dna.htm