Ale jak rozpoznać położenie fragmentów? W tym celu konieczne jest zastosowanie „sondy”, czyli niewielkiego fragmentu DNA znakowanego radioaktywnym izotopem lub rodnikiem, który w określonych warunkach emituje światło. Będąc również fragmentem DNA, sonda zawiera sekwencję, która komplementuje tylko jeden typ niezmiennej sekwencji znanej już w badanym fragmencie, co pozwoli na wiązanie obu.
Za pomocą kliszy fotograficznej ustala się położenie sondy, a tym samym fragmentu. W przypadku miejsc jednomiejscowych – które występują tylko raz w całym genomie – zawsze są dwa „allele”, ponieważ komórki (oprócz reprodukcyjnych) mają po jednej parze każdego chromosomu. Ponieważ allele mają tę samą podstawową sekwencję i różne rozmiary, sonda komplementarna do tej sekwencji zwiąże się z obydwoma i pojawią się w różnych pozycjach na kliszy fotograficznej. Wszyscy ludzie otrzymują jeden z tych alleli od matki i jeden od ojca.
Dlatego w teście na ojcostwo wystarczy porównać allele matki, jej syna (a) i domniemanego ojca oraz zbieżność allelu ojcowskiego dziecka z allelem domniemanego ojca potwierdzi ojcostwo "biologiczny". Jeśli chcesz tylko zbadać tożsamość osoby (na przykład przestępcy), musisz: porównaj wzór polimorfizmu próbek DNA uzyskanych na miejscu zbrodni ze wzorami kilku podejrzanych.
Synteza fragmentów DNA
Aby wykryć polimorfizm, stosuje się startery, które flankują regiony DNA, w których występują powtórzenia nukleotydowe (w grupach po dwa, trzy lub więcej). Oznacza to, że takie startery ograniczają syntezę nowych nici do odcinka z powtórzeniami, zlokalizowanymi pomiędzy miejscami, z którymi się wiążą. Takie powtórzenia nazywane są STR (krótkie powtórzenia tandemowe lub „krótkie powtórzenia w seriach”), a regiony, w których zostały znalezione, znane są jako „mikrosatelity”.
mitochondrialny DNA
Oprócz DNA genomowego, obecnego w jądrze komórkowym, istnieje również DNA w mitochondriach, organellach zlokalizowanych w cytoplazmie. Ten DNA jest znacznie mniejszy niż jądrowy i ma strukturę kolistą, co czyni go bardziej podobnym do DNA bakterii.
W kontekście analizy kryminalistycznej zainteresowanie mitochondrialnym DNA wzrosło z kilku powodów: po pierwsze, ten DNA zawiera również regiony polimorficzne, które umożliwiają jego indywidualizację; po drugie, potomkowie otrzymują to DNA tylko od matki, co pozwala prześledzić rodowód matki danej osoby; i po trzecie, ten DNA jest bardziej odporny na degradację niż jądrowy DNA. Tak więc w przypadku poważnych katastrof (pożary, wybuchy, katastrofy lotnicze itp.), kiedy trudniej jest zidentyfikować ciała, analizowane jest mitochondrialne DNA. Jest on pobierany ze szczątków, a sekwencja będąca przedmiotem zainteresowania jest porównywana z sekwencjami uzyskanymi od rodzeństwa lub przodków ze strony matki.
Stopień pewności testów DNA
Jednym z punktów, który wywołał intensywną dyskusję wśród laboratoriów i agencji zajmujących się testowaniem DNA, jest liczba polimorficznych loci potrzebnych do wiarygodnego ustalenia tożsamości i ojcostwa. Wskaźnik stosowany do wniosków, zarówno na temat tożsamości osoby, jak i ojcostwa, zależy od liczby analizowanych loci. Aby uzyskać odpowiedni wskaźnik, należy jednak wziąć pod uwagę częstość alleli w populacji: jeśli są one bardzo powszechne, wyniki analiz będą co najmniej wątpliwe.
Jako przykład można podać grupy krwi (A, B, O i AB). Takie grupy, które zależą od kombinacji alleli, są rozmieszczone w populacjach na całym świecie ze znaną częstością. W Niemczech 46% do 48% ma krew typu A. W Centralnej Eurazji, Indiach, Mongolii i Syberii dominuje typ B. Dlatego w żadnym z tych regionów nie można było używać tych grup krwi w izolacji do identyfikacji osobnika, ponieważ duży procent populacji miałby jedno lub drugie. Ważne jest, aby badane allele były rzadkie.
W przypadku polimorfizmów DNA (RFLP) częstotliwości są znacznie niższe. Na przykład wyobraźmy sobie spór o ojcostwo w Rio de Janeiro, w którym używa się locus D10S28 jako sonda, pozwalająca uzyskać u rzekomego ojca allel występujący u około 2,8% populacji Rio de Janeiro. Wartość ta jest bardzo wysoka, jeśli weźmiemy pod uwagę, że populacja miasta wynosi około 8 mln mieszkańców. Aby zmniejszyć tę wartość, konieczne jest poszukiwanie innych loci u tego samego osobnika. Wyobraźmy sobie, że druga analiza, wykorzystująca locus D2S44, ujawniła allel z częstością 7,28%, procent wskazujący na istnienie 582 000 osób w Rio de Janeiro z tym allelem.
Ale ile osób miałoby oba allele? Tylko 16307. Liczbę tę uzyskuje się przez pomnożenie odwrotności dwóch częstotliwości: 2,8/100 x 7,28/100 x 8 milionów. Wykorzystując jeszcze jedną lokomotywę, analiza wskaże inną częstotliwość, co pozwoli na dalsze zmniejszenie procentu. W praktyce użycie pięciu do siedmiu sond generuje wartość wystarczająco niską, aby wynik był rozstrzygający.
Źródło: Brazylia Szkoła - https://brasilescola.uol.com.br/biologia/sintese-fragmentos-dna.htm