Ma come riconoscere la posizione dei frammenti? Per questo è necessario utilizzare una “sonda”, cioè un piccolo frammento di DNA marcato con un isotopo radioattivo o con un radicale che emette luce in determinate condizioni. Essendo anche un frammento di DNA, la sonda contiene una sequenza complementare ad un solo tipo di sequenza invariante già nota presente nel frammento in esame, che consentirà il legame di entrambi.
Con l'uso della pellicola fotografica si scopre la posizione della sonda e, quindi, del frammento. Nel caso dei siti a sito singolo - che si verificano una sola volta nell'intero genoma - ci sono sempre due "alleli", perché le cellule (eccetto quelle riproduttive) hanno una coppia di ciascun cromosoma. Poiché gli alleli hanno la stessa sequenza di base e dimensioni diverse, una sonda complementare a quella sequenza si legherà ad entrambi e appariranno in posizioni diverse sulla pellicola fotografica. Tutte le persone ricevono uno di questi alleli dalla madre e uno dal padre.
Pertanto, nel test di paternità, è sufficiente confrontare gli alleli della madre, del figlio (a) e del presunto padre, e la coincidenza dell'allele paterno del bambino con un allele del presunto padre confermerà la paternità "biologico". Quando vuoi solo indagare sull'identità di una persona (un criminale, per esempio), devi confrontare il modello di polimorfismo dei campioni di DNA ottenuti sulla scena del crimine con i modelli di diversi sospetti.
Sintesi di frammenti di DNA
Per rilevare il polimorfismo, vengono utilizzati primer che fiancheggiano regioni del DNA in cui sono presenti ripetizioni nucleotidiche (in gruppi di due, tre o più). Ciò significa che tali primer delimitano la sintesi dei nuovi filamenti al tratto con le ripetizioni, localizzate tra i siti a cui si legano. Tali ripetizioni sono chiamate STR (Short Tandem Repeats, o “brevi ripetizioni in serie”), e le regioni in cui si trovano sono conosciute come “microsatelliti”.
DNA mitocondriale
Oltre al DNA genomico, presente nel nucleo delle cellule, c'è anche il DNA nei mitocondri, organelli situati nel citoplasma. Questo DNA è molto più piccolo del nucleare e ha una struttura circolare, che lo rende più simile a quello dei batteri.
Nell'ambito dell'analisi forense, l'interesse per il DNA mitocondriale è sorto per diversi motivi: primo, questo DNA contiene anche regioni polimorfiche che ne consentono l'individuazione; in secondo luogo, i discendenti ricevono questo DNA solo dalla madre, il che rende possibile risalire al lignaggio materno di una persona; e terzo, questo DNA è più resistente alla degradazione rispetto al DNA nucleare. Così, nelle grandi catastrofi (incendi, esplosioni, incidenti aerei, ecc.), quando è più difficile identificare i corpi, viene analizzato il DNA mitocondriale. Questa viene estratta dai resti e la sequenza di interesse viene confrontata con sequenze ottenute da fratelli o antenati materni.
Grado di fiducia del test del DNA
Un punto che ha generato un'intensa discussione tra i laboratori e le agenzie di test del DNA è il numero di loci polimorfici necessari per stabilire in modo affidabile identità e paternità. L'indice utilizzato per le conclusioni, sia sull'identità di una persona che sulla paternità, dipende dal numero di loci analizzati. Per arrivare ad un indice adeguato, però, è necessario tener conto della frequenza degli alleli nella popolazione: se sono molto comuni, i risultati delle analisi saranno quantomeno dubbi.
I gruppi sanguigni (A, B, O e AB) possono essere usati come esempio. Tali gruppi, che dipendono dalla combinazione di alleli, sono distribuiti in popolazioni di tutto il mondo con frequenze note. In Germania, dal 46% al 48% ha sangue di tipo A. In Eurasia centrale, India, Mongolia e Siberia prevale il tipo B. In nessuna di queste regioni, quindi, questi gruppi sanguigni potrebbero essere usati isolatamente per identificare un individuo, perché una grande percentuale della popolazione avrebbe l'uno o l'altro. È importante che gli alleli indagati siano rari.
Nel caso dei polimorfismi del DNA (RFLP), le frequenze sono molto più basse. Ad esempio, immaginiamo una disputa di paternità a Rio de Janeiro in cui viene utilizzato il locus D10S28 come sonda, permettendo di ottenere, nel presunto padre, un allele presente in circa il 2,8% della popolazione di Rio de Janeiro. Questo valore è molto alto se si considera che la popolazione della città si aggira intorno agli 8 milioni di abitanti. Per ridurre questo valore è necessario ricercare altri loci nello stesso individuo. Immaginiamo che una seconda analisi, utilizzando il locus D2S44, abbia rivelato un allele con una frequenza del 7,28%, una percentuale che indica l'esistenza di 582.000 persone a Rio de Janeiro con questo allele.
Ma quanti individui avrebbero entrambi gli alleli? Solo 16.307. Questo numero si ottiene moltiplicando l'inverso delle due frequenze: 2,8/100 x 7,28/100 x 8 milioni. Utilizzando una loco in più, l'analisi indicherà un'altra frequenza, consentendo di ridurre ulteriormente la percentuale. In pratica, l'utilizzo da cinque a sette sonde genera un valore sufficientemente basso perché il risultato sia conclusivo.
Fonte: Scuola Brasile - https://brasilescola.uol.com.br/biologia/sintese-fragmentos-dna.htm